近日，山东大学微生物改造技术全国重点实验室佘群新教授团队在Nucleic Acids Research上发表了题为“Cyclic tetraadenylate binding induces dimerization of protein dimers to activate a CRISPR-associated PIN nuclease”的研究论文。该研究揭示了古菌III型CRISPR系统新型效应蛋白CaPN的激活机制——cA₄通过诱导蛋白二聚体发生"再二聚化"形成活性四聚体，进而重塑催化中心的全新分子机制。教授佘群新、博士后王方为共同通讯作者，博士后王方、博士研究生赵鹏鹏为论文共同第一作者，山东大学微生物改造技术全国重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。

CRISPR-Cas系统是细菌和古菌中广泛存在的适应性免疫系统，能够特异性识别并抵御病毒等外来遗传物质的入侵。其中，III型CRISPR-Cas系统最为复杂，除对靶标RNA及ssDNA进行切割外，还能合成环寡聚腺苷酸（cOA）作为第二信使激活下游效应蛋白。核苷酸类信号分子，特别是包括cOA（如cA₃、cA₄、cA₆）在内的环核苷酸信号分子，在细胞信号转导中扮演着关键角色。这些分子通过复杂的信号转导网络调控细胞的代谢、基因表达、离子通道活性等生理过程。受cOA激活的效应蛋白通常含有CARF结构域或SAVED结构域，而包含这2种结构域的潜在效应蛋白分为多个进化分枝。值得注意的是，CARFm3分支具有独特的结构域组成，它们通常融合一个常存在于毒素VapC的PIN结构域，且该组合目前仅在古菌中发现。

研究团队以冰岛硫化叶菌为模型，发现了由CARF结构域与PIN结构域融合形成的CRISPR相关PIN核酸酶（CaPN）。研究证实，CaPN能够特异性识别cA₄，并在cA₄的激活下广谱切割多种RNA。通过解析结合cA₄前后CaPN的晶体结构，该团队揭示了CaPN的激活机制：在Apo状态下CaPN形成无活性的二聚体；当其CARF结构域结合cA₄分子后，富含正电荷的cA₄结合口袋因上方Loop的内收而关闭；CARF结构域识别cA₄产生的构象变化进一步传导至PIN结构域，使两个二聚体通过PIN结构域间的相互作用进一步二聚化形成四聚体；上述构象变化可诱导PIN结构域关键催化残基D296重定位至活性中心，组成完整的催化位点，进而发挥RNase活性。CaPN广谱的RNase活性可导致细胞变大，暗示其被cA₄信号激活后可通过降解胞内RNA引起细胞分裂等生理状态变化。这一研究不仅深化了对CRISPR免疫系统多样性的认知，也为下游CARF类效应蛋白的激活机制提供了新的见解。

该研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金和山东省自然科学基金等资助。团队此前已在Ⅲ型CRISPR系统领域取得多项重要成果（Mol Microbiol,2013;Nucleic Acids Res, 2015-2018;Nat Commun, 2019;Mol Cell, 2020;Cell Discov, 2020）。揭示了冰岛硫化叶菌中两个III-B型CRISPR系统Cmrα和Cmrβ的干涉机制，包括Cmrβ的结构及变构激活机制，建立了基于该系统和I-A型CRISPR系统的内源性编辑技术，同时还分析了该III型CRISPR系统的cOA合成活性，阐明了信号通路效应蛋白Csx1的功能和变构激活机制等。这为探究CRISPR系统下游效应蛋白CaPN的研究打下了坚实的基础。

论文链接：https://academic.oup.com/nar/article/53/14/gkaf744/8222437